Взаимодействия вируса бычьего лейкоза с организмом хозяина / Interaction of bovine leukemia virus with the host organism
Взаимодействия вируса бычьего лейкоза с организмом хозяина / Interaction of bovine leukemia virus with the host organism
Еще фото

Автор (ы):  Глазко В.И., РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева, Россия, 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, E-mail: vigvalery@gmail.com, Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Россия, 127422, Москва, ул. Костякова, 12; Косовский Г.Ю., Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Россия; Глазко Т.Т., РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева, Россия, Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Россия / Glazko V.I., Russian State Agrarian University – MAA named after K. A. Timiriazev, Moscow, Russia, Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, Moscow, Russia; Kosovsky G.Yu., Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, Moscow, Russia; Glazko T.T., Russian State Agrarian University – MAA named after K. A. Timiriazev, Moscow, Russia, Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, Moscow, Russia

УДК 636.2:636.01:575.174.015.3:577.2.08:51-76

Аннотация. Представлен обзор данных о взаимодействии дельта-ретровируса бычьего лейкоза с генными сетями и клеточными популяциями организма-хозяина. Обсуждается альтернативность таких характеристик инфицированных животных, как инфекционная опасность, обусловленная прежде всего количеством продуцируемых В-лимфоцитами зрелых вирусных частиц, и развитие у них лимфолейкоза, зависящего от транскрипции и процессинга микроРНК, участвующей в подавлении опухоль-супрессирующих генов и влияющих на метаболические пути, связанные с клеточным делением и клеточной дифференцировкой. Делается вывод о необходимости отделять друг от друга эти характеристики и контролировать первую – путем количественного анализа вирусной РНК в крови, вторую – за счет количественной оценки микроРНК в лимфоцитах..

Summary. The overview of data on the interaction between delta retrovirus bovine leukemia with host gene networks and cell populations was carried out. Alternative characteristics of infected animals, as the dissemination of infection, due, above all, by the quantity of mature viral particles produced in the lymphocytes, and the development of leukemia-specific transcription and processing of microRNAs involved in inhibition of tumor suppressor genes and affected the metabolic pathways related to cell division and cell differentiation were discussed. The conclusion about the need to separate analysis these characteristics and to control the first trait – through quantitative analysis of viral RNA in the blood and the next - to the quantitative assessment of microRNAs in lymphocytes.

Актуальность исследований закономерностей и молекулярно-генетических основ распространения вируса бычьего лейкоза (BLV) обусловлена прежде всего экономическими потерями в молочном скотоводстве (около 525 млн долларов в год), связанными с распространением этой инфекции [1]. Приблизительно 38% мясного скота, 84% молочных стад и около 100% специализированного молочного скота  США инфицировано BLV [2]. Менее 5% инфицированных животных проявляют клинические признаки развития лейкоза.

Тем не менее, у таких животных инфицированные BLV-лимфоциты циркулируют в крови, инфицированные BLV клетки обнаруживаются среди эпителия молочных желез коров, а также такие клетки выявляются в молоке инфицированных коров.

Несмотря на то, что впервые лейкоз крупного рогатого скота был описан в 1871 г., до сих пор в молочном скотоводстве не удалось уменьшить связанные с ним существенные экономические потери [3]. Это может быть обусловлено многими причинами, в частности, недостаточной изученностью взаимодействий между вирусом и многоклеточным организмом хозяина. Так, например, обнаружено, что единичная мутация сайта гликозилирования N-конца поверхностного гликопротеина приводит к резкому повышению патогенности BLV, что свидетельствует о наличии коэволюции между хозяином и патогеном, препятствующем увеличению патогенности выше определенного предела [4]. Показано отсутствие корреляций между кинетикой размножения вируса и иммунореактивностью животных, способностью BLV инфицировать не только B-лимфоциты, но и другие клеточные популяции, и др. [5].

В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что среди клеток эпителия молочной железы у женщин с раком молочной железы наблюдается повышенная частота встречаемости клеток, инфицированных BLV [2]. В этой работе отмечается, что с использованием антител к капсидному белку BLV (p24) в 6% случаев из 219 образцов эпителия молочной железы женщин было выявлено его присутствие, что свидетельствует о воспроизводстве BLV. Обнаружено также, что в эпителии молочной железы пациентов с раком молочной железы провирусная ДНК BLV встречается у 59%, у здоровых женщин – у 29%, а у женщин с предраковой патологией – с промежуточной частотой в 38%. Судя по этим цифрам, инфицированность молочных желез женщин BLV вряд ли может рассматриваться как индуктор развития неоплазий, но не исключено, что может выполнять в этом процессе определенную ускоряющую роль.

Следует подчеркнуть, что обычно у крупного рогатого скота, инфицированного BLV, выявляется меньше 1% клеток в периферической крови, несущих в геноме провирусную ДНК [6]. После реализации первых стадий инфицирования, провирусная ДНК массово встраивается в активно транскрибируемые участки генома хозяина, однако в последующем только единичные клеточные клоны сохраняют интегрированные в геном копии провирусной ДНК, и только единичные из них в последующем лежат в основе формирования опухолевых клеток [7]. Генетические основы предпочтительной неопластической трансформации одних клеток и элиминации других, несмотря на наличие интегрированной провирусной ДНК, до сих пор остаются неизвестными. Можно ожидать, что определенный вклад в такую клональную дифференциацию могут вносить события, связанные с влиянием интегрированного провируса на экспрессию собственных генных сетей хозяина, в частности, с его иммунной системой [8], с метаболическим путем опухоль-некротического фактора альфа [9]. По-видимому, сложным влиянием продуктов генов провирусной ДНК на иммунную систему хозяина могут быть объяснены и трудности с разработками методов вакцинации против BLV [10]. Кроме того, не только рецепция поверхностных белков вируса на клетках-мишенях его действия, но и сама интеграция провирусной ДНК в геном хозяина критическим образом зависит от клеточных белков хозяина, в частности, от взаимодействия c таким клеточным белком с широкой субстратной специфичностью, как серин/треонин фосфатаза белков 2A (PP2A) [Maertens G.N. B’-protein phosphatase 2A is a functional binding partner of delta-retroviral integrase. Nucleic Acids Res. 2016;44(1):364-76. (doi:10.1093/nar/gkv1347)].

Совокупность накопленных данных свидетельствует о том, что только глубокие исследования структурно-функциональной организации генома дельта-ретровируса, BLV, могут позволить в конечном итоге разработать наиболее эффективные методы диагностики инфицированных животных и прогноза таких характеристик, как их инфекционная опасность, перспективы развития у них лимфолейкозов.

Полноразмерный геном BLV состоит из 8714 нуклеотидов, включает ряд структурных генов gag, pro, pol, env и два идентичных длинных концевых повтора (long terminal repeats – LTRs). Детали геномной организации BLV представлены на рис. 1.

BLV gag ген транслируется как предшественник Pr70 Gag, который процессируется в три зрелых белка: белок матрикса p15 (MA), капсидный белок p24 (CA) и нуклеокапсидный белок p12 (NC). BLV pro и pol гены кодируют протеазы (Pro) p14 и p80, обратную транскриптазу (RT) и интегразу (IN). Ген env кодирует поверхностный гликопротеин (gp51) и трансмембранный белок (gp30). BLV-геном содержит область pX, расположенную между геном env и 3′ LTR. В этой области кодируются по меньшей мере 4 белка, включая регуляторные белки Tax и Rex, и вспомогательные белки R3 и G4.

Tax-белок активно исследуется, и предполагается, что он играет критическую роль в BLV-индуцируемом лейкемогенезе. Белок Rex отвечает за ядерный экспорт вирусной РНК и способствует цитоплазматическому накоплению и трансляции вирусной матричной РНК (мРНК) в BLV-инфицированных клетках. Белки R3 и G4 способствуют поддержанию высокой вирусной нагрузки. Белок G4 особенно важен для лейкемогенеза, поскольку известно, что он участвует в иммортализации первичных эмбриональных фибробластов. BLV G4 – фарнезил пирофосфат синтаза (FPPS), фермент мевалонат метаболического пути, тесно связан    с синтезом FPP – субстрата, необходимого для модификации серина фарнезилом в Ras онкогене. Такое пренилирование (липидные модификации) ras, как предполагается, играет существенную роль в его канцерогенной активности. Кроме того, FPPS участвует в синтезе изопреноидов, влияющих на текучесть и стабильность мембран. BLV G4 выявляется в ядре и митохондриях.

R3 белок участвует в поддержании инфекции, локализуется в ядре и в плазматической мембране клеток. Кроме того, РНК-полимераза III (pol III) транскрибирует вирусную микроРНК, уровень транскрипции которой особенно выражен в предлейкозных и опухолевых клетках, в которых подавлена транскрипция структурных и регулирующих экспрессию генов, что свидетельствует о возможной ключевой роли в неопластической трансформации и прогрессии клеток.

Env gp51 гликопротеин играет важную роль в жизненном цикле вируса. gp51 требуется для вхождения вируса в клетку и является основной мишенью для нейтрализующих антител. Лидирующий N-концевой домен gp51 содержит три конформационных эпитопа, F, G и H, и играет важную роль в вирусной инфекции и образовании синцития, в то время как C-концевой домен gp51 содержит линейные эпитопы A, B, D, и E. Поэтому gp51 широко используется для генотипирования BLV. Недавние филогенетические исследования этого региона в вирусных штаммах, выделенных во всем мире, демонстрируют, что в этом районе BLV можно выделить, по крайней мере, девять генотипов [12].

Инфекция BLV сопровождается массовой гибелью клеток, несущих интегрированный провирусный геном [6]. Такая гибель обусловлена и реакцией иммунной системы хозяина на антигены вируса, и тем, что интеграция провирусной ДНК в активно транскрибирующиеся районы  генома  хозяина  может  приводить к снижению жизнеспособности клеток, особенно когда провирусная ДНК встраивается в регуляторные или кодирующие последовательности жизненно важных структурных генов. То есть, в общем случае естественный отбор направлен против клеточных популяций, в которых активно экспрессируется провирусная  ДНК. Это обстоятельство позволяет достаточно четко противопоставлять высокую продуктивность зрелых вирусных частиц инфицированными клетками и клеточные клоны, предрасположенные к неопластической  транс-формации, для которых важным условием является «незаметность» для иммунной системы хозяина. Очевидно, что для понимания механизмов индукции BLV лимфолейкоза необходимо выяснить, как получается, что клетки индуцируемых опухолей несут в своем геноме интегрированную провирусную ДНК, но в них она не экспрессируется, по крайней мере, РНК полимеразой II (pol II), и отсутствуют соответствующие белки BLV [13].

В этой связи особый интерес вызывают работы, связанные с экспрессией микроРНК BLV. Так, было показано, что в пренеопластических и опухолевых клетках, искусственно индуцированных BLV у овец, отсутствует транскрипция провирусной ДНК, контролируемая pol II, но транскрибируется, с участием pol III, участок провирусной ДНК между геном env и 3’LTR [14]. В этом участке присутствуют 5 микроРНК, причем их представленность достигает 40% от суммарной микроРНК в экспериментальных и возникающих естественным путем опухолевых клетках, индуцированных BLV. Схема организации 5 микроРНК в провирусном геноме BLV представлена на рис. 2.

Количество копий микроРНК на  опухолевую  клетку достигает более 80 тысяч. Судя по консервативности последовательностей  микроРНК, они  подвергаются «очищающей» селекции и ассоциированы с белками-аргонавтами, играющими ключевую роль в разрушении двуцепочечной РНК и блокировании экспрессии разных клеточных и вирусных транскриптов. Обнаружено также, что в индуцированных BLV опухолевых клетках овцы подавлена экспрессия опухолевого супрессора HBP1 (High Mobility Group Box Transcription Factor). Это репрессор транскрипции, связывающийся с промоторами генов-мишеней. Участвует в регуляции клеточного цикла и в метаболическом пути Wnt, преимущественно связывается с последовательностью 5-TTCATTCATTCA-3. Его связывание с промотором гистона H1F0 усиливается при взаимодействии с RB1. Нарушает взаимодействие между DNA и фактором транскрипции 4 (TCF4). Подавление экспрессии HBP1 обнаруживается и в B-лимфомах мыши и человека, в которых главным фактором этого является микроРНК-29a. Один из вариантов микроРНК BLV, BLV-miR-B4, имеет идентичную последовательность со специфической «зерновой» частью miR-29 хозяина (2-8 нуклеотиды). Показано, что мишенями BLV-miR-B4 и miR-29a являются два транскрипта, ранее выявленных в связи с индуцированным miR-29 B-клеточным лейкогенезом у мышей [13].

Созревание микроРНК в большинстве случаев реализуется по общему пути, где ключевую роль играют процессы разрезания первичного транскрипта, затем транспорт в цитоплазму и с участием Dicer удаление петли, затем присоединение к РНК-индуцируемому комплексу выключения накопления продукта гена (рис. 3). Особенностью процессинга микроРНК BLV является получение первичного транскрипта с участием pol III, а не pol II, отсутствие влияния фермента Drosha. В связи с тем, что, по мнению многих авторов, у инфицированных животных идет отбор против лимфоцитов, в которых идет транскрипция провирусной ДНК BLV [15], одним из направлений защиты животных является активация транскрипции провирусной ДНК с целью увеличить частоту гибели клеток со встроенным в геном провирусом [6]. Такой подход основан на предположении о том, что иммунореактивность эффекторных клеток иммунной системы не меняется в процессе развития различных стадий патогенеза и что при индукции транскрипции провирусной ДНК изменяется направление отбора и существенно уменьшается количество клеток с «молчащей» провирусной ДНК, но транскрибируемой микроРНК.

В общем, из накопленных к настоящему времени данных следует, что продукция зрелых вирусных частиц, способных инфицировать новые клетки и новые организмы, находится в антагонистических взаимоотношениях с механизмами неопластической трансформации клеток: транскрипция полноразмерной провирусной ДНК BLV альтернативна транскрипции кластера микроРНК BLV. И если накопление клеток, продуцирующих зрелые вирусные частицы, контролируется иммунной реактивностью хозяина, в том числе и продукцией соответствующих антител, активностью популяций цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), то во втором случае – активностью внутриклеточных систем, определяющих транскрипцию и процессинг микроРНК BLV. То есть, инфекционная опасность животных и прогноз развития у них лимфолейкоза, с этой точки зрения, требуют различных методов контроля и, по-видимому, подходов к оздоровлению стад. Инфекционная опасность животных может быть определена прямым количественным анализом вирусной РНК BLV в периферической крови, а вероятность неопластической трансформации клеток – количеством микроРНК BLV в лимфоцитах, что доступно для анализа с использованием RT-PCR.


Литература

1.     Gillet N., Florins A., Boxus M. et al. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. Retrovirology. 2007; 4: 18 (http://www.retrovirology.com/content/4/1/18)].

2.     Buehring G.C., Shen H.M., Jensen H.M., Jin D.L., Hudes M., Block G. Exposure to Bovine Leukemia Virus Is Associated with Breast Cancer: A Case-Control Study. PLoS ONE. 2015; 10(9): e0134304. (doi:10.1371/journal.pone.0134304).

3.     Rodríguez S.M., Florins A., Gillet N., de Brogniez A., Sánchez-Alcaraz M.T., Boxus M., Boulanger F., Gutiérrez G., Trono K., Alvarez I., Vagnoni L., Willems L. Preventive and Therapeutic Strategies for Bovine Leukemia Virus: Lessons for HTLV. Viruses. 2011; 3: 1210–12487.

4.     de Brogniez A., Bouzar A.B., Jacques J. R., Cosse J. P., Gillet N., Callebaut I., Reichert M., Willems L. Mutation of a single envelope N-linked glycosylation site enhances the pathogenicity of bovine leukemia virus. J Virol. 2015; 89: 8945–8956. (doi:10.1128/ JVI.00261-15).

5.     Panei C.J. Estimation of bovine leukemia virus (BLV) proviral load harbored by lymphocyte subpopulations in BLV infected cattle at the subclinical stage of enzootic bovine leucosis using BLV-CoCoMo-284 qPCR. C.J. Panei, S. Takeshima, T. Omori et al. BMC Veterinary Research. 2013; 9: 95. (http://www.biomedcentral.com/1746-6148/9/95).

6.     Barez P.Y., de Brogniez A., Carpentier A., Gazon H., Gillet N., Gutiérrez G., Hamaidia M., Jacques J.R., Perike S., Neelature Sriramareddy S., Renotte N., Staumont B., Reichert M., Trono K., Willems L. Recent Advances in BLV Research. Viruses. 2015; 7(11): 6080–8. (doi: 10.3390/v7112929).

7.     Gillet N.A., Gutie´rrez G., Rodriguez S.M., de Brogniez A., Renotte N., Alvarez I., Trono K., Willems L. Massive Depletion of Bovine Leukemia Virus Proviral Clones Located in Genomic Transcriptionally Active Sites during Primary Infection. PLoS Pathog. 2013; 9 (10): e1003687. (doi:10.1371/journal.ppat.1003687)

8.     Arainga M., Takeda E., Aida Y. Identification of bovine leukemia virus tax function associated with host cell transcription, signaling, stress response and immune response pathway by microarray-based gene expression analysis. BMC Genomics. 2012; 13: 121. (doi: 10.1186/1471-2164-13-121)

9.     Twizere J.C., Kruys V., Lefebvre L., Vanderplasschen A., Collete, D., Debacq C., Lai W.S., Jauniaux J.C., Bernstein L.R., Semmes O.J. et al. Interaction of retroviral Tax oncoproteins with tristetraprolin and regulation of tumor necrosis factor-alpha expression. J. Natl. Cancer Inst. 2003; 95: 1846–1859.

10.     Gutiérrez G., Rodríguez S.M., de Brogniez A., Gillet N., Golime R., Burny A., Jaworski J.P., Alvarez I., Vagnoni L., Trono K., Willems L. Vaccination against δ-retroviruses: the bovine leukemia virus paradigm. Viruses. 2014; 6(6):2416–27. (doi: 10.3390/v6062416).

11.     Maertens GN. B’-protein phosphatase 2A is a functional binding partner of delta-retroviral integrase. Nucleic Acids Res. 2016; 44(1): 364–76. (doi:10.1093/nar/gkv1347).

12.     Polat M., Takeshima S.N., Hosomichi K., Kim J., Miyasaka T., Yamada K., Arainga M., Murakami T., Matsumoto Y., de la Barra Diaz V., Panei C.J., González E.T., Kanemaki M., Onuma M., Giovambattista G., Aida Y. A new genotype of bovine leukemia virus in South America identified by NGS based whole genome sequencing and molecular evolutionary genetic analysis. Retrovirology. 2016; 13(1): 4. (doi: 10.1186/s12977-016-0239-z).

13.     Kincaid R.P., Burke J.M., Sullivan C.S. RNA virus microRNA that mimics a B-cell oncomiR. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(8): 3077–82. (doi: 10.1073/pnas.1116107109)

14.     Rosewick N., Momont M., Durkin K., Takeda H., Caiment F., Cleuter Y., Vernin C., Mortreux F., Wattel E., Burny A., Georges M., Van den Broeke A. Deep sequencing reveals abundant noncanonical retroviral microRNAs in B-cell leukemia/lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110(6): 2306–11. (doi: 10.1073/pnas.1213842110)

15.     Gillet N.A., Hamaidia M., de Brogniez A., Gutiérrez G., Renotte N., Reichert M., Trono K., Willems L. The bovine leukemia virus microRNAs permit escape from innate immune response and contribute to viral replication in the natural host. Retrovirology. 2015; 12(Suppl 1): O9. (doi:10.1186/1742-4690-12-S1-O9)].



Назад в раздел