Метод лабораторной диагностики хинолонов в пчелином меде
Метод лабораторной диагностики хинолонов в пчелином меде
Еще фото

Автор (ы):  Надежда Стойлова, Msc, Георги Стоев, профессор
Организация(и):  Центральная лаборатория ветеринарной санитарной экспертизы и окружающей среды, отдел РНМАВМП (Разработки новых методов и анализа лекарственных препаратов), София

Перевод: Л.А. Калашникова

Аннотация

Антибактериальные препараты обладают высокой активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий: ингибируют ДНК-гиразы в бактериальных клетках вплоть до их уничтожения. Содержание остаточного количества хинолонов в пищевых продуктах животного происхождения, предназначенных для потребления человеком, возможно при передозировке или несоблюдении установленных законом сроков карантина. Разработанный в нашей лаборатории многокомпонентный метод для определения остаточного количества хинолонов в различных типах ткани: мышцах, почках, молоке, яйцах, рыбе, - адаптирован для проверки пчелиного меда. Для продукта «пчелиный мед» нет установленных величин ПДК выше аналитических, следовательно, не допускается никаких остаточных количеств хинолонов.

Введение

В последние годы увеличивается микробиологическая резистентность организма и необходимо осуществлять строгий контроль наличия остаточных количеств антибактериальных веществ, в том числе хинолонов, в пище, предназначенной для потребления человеком. Фторхинолоны являются относительно новым классом соединений, входящих в состав лекарственных препаратов, используемых в ветеринарии. Для того, чтобы защитить здоровье человека от воздействия потенциально вредных веществ, установлены максимальные уровни содержания (ПДК) фармакологически активных веществ, в том числе хинолонов, в различных видах животноводческой продукции и продуктов питания животного происхождения [3, 16]. Это приводит к необходимости разработки и утверждения чувствительного и селективного метода для идентификации и количественного определения фторхинолонов.

Хинолоны - это синтетические вещества различного химического строения, являющиеся производными 4-хинолон-карбоновой кислоты. Структура хинолонов включает в себя 1-замещенные-1,4-дигидро-4-оксипиридин-3-карбоновые части ароматических и гетероароматических колец. Известно, что среди так называемых кислых (оксолиновая кислота, флумекин, налидиксовая кислота) и амфотерных (норфлоксацин, ципрофлоксацин, данофлоксацин, энрофлоксацин, дифлоксацин, сарафлоксацин) хинолонов имеется различие в рКа молекуле, которое имеет значение для их извлечения из матрицы и последующего инструментального определения. Фторхинолоны, которые имеют только одно значение рКа, называют кислыми, в отличие от тех, которые имеют два рКа, обозначаемые как пиперазиниловые. Хинолоны пиперазинилового типа называются еще основными (и амфотерными), поскольку у них в молекуле имеется аминогруппа.

Фторхинолоны являются гетероциклическими ароматическими соединениями, содержащими азот, катионные и карбоксильные группы. Первым синтезированным хинолоном является налидиксовая кислота. После ее создания практика синтеза оказалась относительно ограниченной. Потребовался синтез различных модификаций и, следовательно, создания веществ с алкил, арил-группами и фтор-и пиперазиниловых заместителей в молекуле в позициях 6 и 7, как представителей этого класса соединений [14, 15].

Разработанный нами метод является многокомпонентным и предназначен для определения хинолонов в пробах животного происхождения.

Метод утвержден в соответствии с требованиями Предписания 657/2002/EС, обеспечивающего проверку правил и критериев оценки методов, используемых в лаборатории, которые предназначены для борьбы с загрязнением пищевых продуктов [2].

В научной литературе публикаций, касающихся определения остатков антибактериальных веществ, в частности, хинолонов, очень много. Большинство статей представляют проведение инструментального анализа методом жидкостной хроматографии в сочетании с различными методами обнаружения. Преобладают статьи, представляющие применение, в первую очередь, техники LC-MS/MS детекции [7, 8, 14], также широко пропагандируется метод детекции на основе флуоресценции [4, 6, 11, 15], что обусловлено высокой чувствительностью этого типа детекции. Значительное число публикаций, относящихся к многокомпонентному анализу, представляют методы ВЭЖХ, LC/MS, GC, CE, включая ТФЭ, TTE и другие способы экстракции, очистки и предварительной концентрации [1, 9, 11, 12]. Относительно мало статей, представляющих протоколы для одновременной экстракции и определения веществ из группы хинолонов в различных продуктах, особенно в пчелином меде.

M. Rose, Bygrave, Stubbing предлагают методику определения хинолонов в продуктах питания. Авторы представляют два способа экстракции фторхинолонов (за исключением флумекина), и еще одного способа, связанного с обработкой кислот. Соответственно, очистка и концентрирование анализируемых вешеств осуществляется на основе катионного обмена для фторхинолонов и анионного обмена для кислот. В пчелином меде определено только три компонента: энрофлоксацин, ципрофлоксацин и норфлоксацин. Аналитический выход составил 50% для норфлоксацина, 78% для ципрофлоксацина и 63% для энрофлоксацина на уровне 50 мг/кг. Авторы полагают, что невозможно валидировать метод одновременного определения фторхинолонов, вследствие со-элюирования и других веществ. Отмечено, что для осуществления хроматографического анализа требуется применение различных условий хроматографии [12].

Florida Department of Agriculture and Consumer Services [5] представили метод определения фторхинолонов в пчелином меде. Определены только энрофлоксацин и ципрофлоксацин, а пробоподготовка включает растворение пчелиного меда в воде и последующую эктракцию ацетонитрилом после подкисления среды. Инструментальный анализ проводится методом LC-MS/MS. В публикации отмечено, что растворы, содержащие энрофлоксацин и его основной метаболит, ципрофлоксацин, пригодны для использования в течение 24 часов после подготовки основного исходного раствора! Подготовленный исходный стандартный раствор должен храниться при температуре от 10ºC, а рабочие растворы готовят непосредственно перед использованием.

В статье [18] определяются остаточные количества марбофлоксацина, эноксацина, пефлоксацина, энрофлоксацина, ломефлоксацина, дифлоксацина, флероксацина, офлоксацина, ципрофлоксацина, данофлоксацина, орбфлоксацина и сарафлоксацина. Предлагается способ пробоподготовки, который включает в себя экстракцию анализируемых вешеств ацетонитрилом, затем обработку гексаном, упаривание досуха в потоке азота и восстановление в 1 мл подвижной фазы. Метод, используемый для инструментального анализа - ВЭЖХ с УФ-детектором. Авторы сообщают, что пик обнаружения веществ пересекается с другими пиками, то есть наблюдается интерференция. Эта проблема возникает не из-за коррекции очистки и концентрации образцов, а при помощи другой модели обработки результатов хроматографии.

Химические вещества и реактивы, необходимые технические и вспомогательные средства:

Химические вещества

Растворители

Вода - деионизированная milliQ

Ацетонитрил, Merck, для анализа, ЧДА (AR)

Метанол LabScan, HPLC

Ацетонитрил LiChrosolv, Merck

Реагенты

Муравьиная кислота, ЧДА

Ацетат аммония Merck, для анализа, ЧДА

Гидроксид натрия, ЧДА

Аммиак, ЧДА .

Технические средства

Жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series,с дегазатором, четвертичный насос, автоматический инжектор, термостат колонки, детектор флуоресценции, программное обеспечение ChemStation

Аналитические колонки Zorbax Eclipse XDB C18, 250/3,0 мм, 5 мкм, Agilent Technologies

Предколонка Zorbax Eclipse XDB C18

Вспомогательные технические средства

Аналитические весы Sartorius BP 221S

Технические весы Sartorius BP 610

рН-метр Inolab 1-го уровня

Мерные колбы/стекло

Мерные колбы / полипропилен

Пипетки типа «Резила»

Измерительный цилиндр

Пробирки центрифужные

Пробирки конические, полипропилен

Стаканы

Фильтры Nylon 0,45 мкм

Виалки

Картриджи HLB / Waters или STRATA X/Phenomenex

Стандартные вещества

Таблица 1

Наименование

Идентификационый № производителя

Сертифицированные значения (чистота)

Срок годности

Norfloxacin

Норфлоксацин

33899

Fluka

• 99%

01.04.

2015

Ciprofloxacin

Ципрофлоксацин

33434

Fluka

• 99%

10,06

2015

Danofloxacin

Данофлоксацин

7302

Riedel de Haen

• 99%

10.2011

Enrofloxacin

Энрофлоксацин

33699

Fluka

• 99%

02.12.

2014

Difloxacin

Дифлоксацин гидрохлорид

SZBA166XV

Fluka

• 99%

06.2015

Sarafloxacin

Сарафлоксацин гидрохлорид тригидрат

SZBA014XV

Fluka

• 99%

01.2014

Oxolinic acid

Оксолиновая кислота

C15788000

Dr Ehrenstorfer

02.2011

Flumequin

Флумекин

45735

Fluka

14.01.

2015

Nalidixic acid

Налидиксовая кислота

70162

Fluka

03.2012

Приготовление растворов

Стандартные растворы хинолонов (1 г/л)

1 мг каждого стандарта хинолонов взвешивали и растворяли отдельно в 1 мл метанола и 50 мкл 1М NaOH (в соответствии с литературными данными для растворимости соответствующих хинолонов).

Полученные исходные стандарты должены храниться в холодильнике и не пригодны для использования в период более 3 месяцев. Используются для приготовления рабочих растворов, используемых в день анализа.

Растворы приготавливали в полипропиленовых мерных колбах.

Подвижная фаза HPLC

Подвижная фаза А- 0,1% НСООН (100 мкл НСООН в 99,9 мл деионизированной воды)

Подвижная фаза В- Ацетонитрил

Подвижная фаза C метанол

Скорость фазового потока - 0,5 мл / мин

Температура колонки: 50±10C

Инъекция объем - 25мкл

Условия хроматографии:

Программа градиентного элюирования

Таблица 2

Таким образом, чтобы осуществить хроматографическое разделение мультикомпонентной смеси, используется градиентное элюирование. Отношение метанола (фаза С) остается постоянным, т. е. 2%. Фаза C составляет 15% от 0 до 15 мин, с 9 по 12 мин объем изменяется до 20%, до 35% от 17 до 19 минут, до 40% на 23 мин, затем от 26 минут до конца анализа возвращается на 15%.

Обнаружение - программа для изменения длины волны возбуждения (λex) и эмиссии (λem) (табл. 2)

Таблица 2

Время / мин

λex

λem

0,0

280

450

11,0

280

450

12,0

312

360

28,0

312

360

29,0

280

450

Инъекция объем - 25 мкл

Время анализа - 34 мин

Подготовка проб пчелиного меда

В условиях массового анализа, в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку взвешивали 1 г меда. Добавляли 2,5 мл дистиллированной воды. Пробу гомогенизировали. Добавляли 2,5 мл дихлорметана, 5 мл ацетона и 0,5 г хлорида натрия. Образец снова гомогенизацировали на шейкере в течение 10 минут. Далее центрифугировали при 00С и 7500об/мин в течение 10 минут. Декантировали верхний слой из полипропиленовой пробирки. Повторяли экстракцию, как описано выше, но без добавления хлорида натрия. Объединенные органические слои упаривали досуха в потоке азота. Сухой остаток растворили в 5 мл 20 мМ ацетата аммония рН = 9,0, обработали ультразвуком, на вортексе и центрифугировали при 00С в течение 5 мин при 7500 об/мин. Экстракт образца подвергали очистке на ТФЭ картридже (картриджи для твердофазной экстракции). Процедура включает в себя кондиционирование и уравновешивание при заполнении картриджей. Последовательно картридж заполняли 1 объемом метанола и 20 мм ацетата аммония рН = 3,0, затем восстанавливали путем применения 20 мм рН ацетата аммония = 9,0 и образца экстракта, затем промывали 1 объемом деионизированной воды и элюировали аналиты в 10 мл 0,2% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Элюаты выпаривали досуха в токе азота на водяной бане. Сухой остаток растворяли в 1 мл 0,1% муравьиной кислоты в воде с ацетонитрилом в соотношении 9:1. Далее следовал инструментальный анализ.

Результаты и обсуждение

С момента разработки и утверждения метода на других типах продуктов проводились тесты на стабильность и повторяемость результатов, необходимые для определения условий для извлечения анализируемых веществ из пчелиного меда. С этой целью мы провели эксперименты, относящиеся к растворимости пчелиного меда. При использовании традиционных методов установлено, что пчелиный мед не растворяется в ацетонитриле (рис. 1а). По этой причине мы решили растворять пчелиный мед в воде. Учитывая разницу в рКа анализируемых вешеств, мы провели последующую экстракцию фторхинолонов в ацетонитриле в среде без изменения рН и с изменением рН среды {1}(похоже на извлечение сульфаниламидов из матрицы пчелиного меда [9], на рисунке 1 б, в). Полученные результаты после хроматографического анализа представлены на рисунке 1. Видно, что при рН = 5 пики анализируемых вешеств были неправильной формы, а некоторые из них имели очень большую площадь, которая является признаком того, что произошла экстракция других веществ, отличных от интересующих нас анализируемых вешеств (рис. 1в). При растворения пчелиного меда в воде, без корректировки рН среды и последующей обработки образцов, как описано выше, форма пиков, полученных инструментальным анализом, была более правильной (рис. 1г).

В соответствии с Предписанием 657/2002, связанным с Предписанием Совета 96/23/EC, регламентируются внедрение и использование аналитических методов и интерпретация результатов: «Валидация означает подтверждение путем определения и представления эффективных доказательств того, что специальные требования относительно специфического предназначения использования метода выполняются».

Основными требованиями, которые показывают, что аналитический метод соответствует критериям валидации, являются:

- специфичность;

- избирательность;

- точность;

- стабильность (устойчивость);

- прецизионность;

- воспроизводимость;

- линейность и рабочий диапазон калибровочной кривой;

- аналитическая воспроизводимость;

- граница несоответствия CCα;

- обнаружение возможности CCβ.

Специфичность и селективность

Возможности разработанного метода в различии пика анализируемого вешества от других близко расположенных пиков на хроматограмме. С этой целью образцы пчелиного меда были обработаны в соответствии с описанием метода анализа и проанализированы при помощи RP-HPLC. В области времени прохождения отдельных хинолонов, при соответствующей длине волны эмиссии пики не регистрировались. Это указывает на селективность и специфичность аналитического метода, рисунок 1 д.

Точность

Определяется при помощи CPM (сертифицированных референтных материалов). Если CPM недоступны, то для определения точности могут быть использованы аналитические выходы.

Примеры значений аналитических выходов являются приемлемыми и представлены в таблице 4:

Таблица 4

Аналитические выходы матрицы «пчелиный мед»

Норфлаксацин

15 мкг/кг

30 мкг/кг

45 мкг/кг

60мкг/кг

101%

96%

100%

98%

Ципрофлоксацин

15 мкг/кг

30 мкг/кг

45 мкг/кг

60мкг/кг

126%

90%

87%

108%

Данофлоксацин

15 мкг/кг

30 мкг/кг

45 мкг/кг

60мкг/кг

101%

102%

96%

101%

Енрофлоксацин

15 мкг/кг

30 мкг/кг

45мкг/кг

60мкг/кг

104%

99%

97%

102%

Дифлоксацин

100 мкг/кг

200мкг/кг

300мкг/кг

400 мкг/кг

86%

104%

107%

95%

Сарафлоксацин

15мкг/кг

30 мкг/кг

45мкг/кг

60 мкг/кг

99%

100%

99%

101%

Оксолиновая кислота

15 мкг/кг

30мкг/кг

45 мкг/кг

60мкг/кг

118%

79%

89%

61%

Флумекин

150 мкг/кг

300 мкг/кг

450 мкг/кг

600мкг/кг

108%

99%

92%

103%

Налидиксовая кислота

15мкг/кг

30 мкг/кг

45мкг/кг

60 мкг/кг

95%

101%

101%

98%

Устойчивость метода

Выбор осуществлялся между различными факторами, которые могут повлиять на использование этого метода. Они включают, например: значения температуры, кислотности среды, количество и срок хранения реагентов, химических веществ, реактивов, стандартных веществ и др. Если будет установлено такое влияние, то это должно быть упомянуто в описании метода. [2, 5]

Стабильность метода

Определяется на стандартных растворах и анализируемом продукте. Наше исследование констатирует, что исходный стандартный раствор стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике, подготовке в полипропиленовых мерных колбах и добавлении гидроксида натрия. Полученные данные соответствуют данным, описанным в литературе.

Линейность и рабочий диапазон

Возможности метода определяются прямой пропорциональностью результатов тестов концентрации анализируемых веществ в рабочем диапазоне, то есть линейной зависимостью. Рабочий диапазон - это интервал между самым высоким и минимальным значениями анализируемых вешеств, которые определяются с необходимой прецизионностью, точностью, линейностью при использовании этого метода. Это определение требует, по крайней мере, применения 5-ти уровней концентраций. Для оценки возможностей метода анализируется несколько стандартных растворов хинолонов различной концентрации, а также проб пчелиного меда, контаминированных в том же интервале концентраций, какие использовались при анализе чистых стандартов. Предоставляется графическая зависимость между концентрацией и площадью хроматографических пиков при анализе стандартных образцов и пиковых проб. Таким образом, описывается рабочий диапазон, математические формулы и коэффициенты коррекции.

Точность метода: повторяемость (SD мкг/кг) и воспроизводимость (RSD%)

Точность является мерой повторяемости аналитического метода. Точность представляется через ​​SD (стандартное отклонение) и RSD (относительное стандартное отклонение) при статистической обработке большого количества результатов. Точность определяется, по крайней мере, по 9-ти измерениям, охватывающим определенный диапазон (например, 3 уровня с 3 повторениями для каждого уровня), или, по крайней мере, 6 определений в случае аналитических выходов, где она составляет 100%. Когда инъецируется только стандарт, значение отклонения не должно превышать 1,5%!

Определение повторяемости проводили путем анализа образцов пчелиного меда с добавлением стандартов хинолонов. Образцы были анализированы неоднократно.

Воспроизводимость определяется путем многократного анализа образцов, содержащих смесь хинолонов, по методике, описанной в разделе Материалы и методы, но в течение более длительного периода времени. Эксперименты выполнялись в той же лаборатории, но в меняющихся условиях, таких как: оператор, партия растворителя, температура окружающей среды.

Граница несоответствия CCα:

В соответствии с Предписанием 657/2002/ES, граница несоответствия ограничивается уровнем и выше него, с вероятностью ошибки α, сверх которой результат не соответствует необходимым требованиям.

Возможность обнаружения CCβ:

Наименьшее количество анализируемых вешеств, которое можно обнаружить, идентифицировать и количественно определить с вероятностью ошибки β, опять же в соответствии с Предписанием 657/2002/ES.

Значения, полученные при соблюдении повторяемости, воспроизводимости, линейности, в пределе рабочего диапазона, границы несоответствия, а также возможности обнаружения представлены в таблице 5:

Таблица 5

Мед

Сарафлок-ацин

Дифлоксацин

Ципрофлоксацин

Энрофлоксацин

Данофлоксацин

Оксолиновая кислота

Налидиксовая кислота

Норфлоксацин

Флумекин

Повторяемость (SD мг/кг)

0,17

4,39

1,69

0,39

0,12

1,13

2,77

0,54

2,08

Воспроизводимость

(RSD%)

1,19

5,14

8,33

2,45

0,66

8,85

19,7

3,44

1,37

Граница несоответствия CCα

16,9

107

19,1

17,1

16,9

18,4

19,3

17,2

157

Возможность обнаружения

CC β

18,3

112

22,1

18,6

18,3

20,2

22,3

18,8

161

ПДК

Рабочий диапазон метода

нет правила

15 ÷ 60

мкг/кг

нет правила

100 ÷ 400

мкг/кг

нет правила

15 ÷ 60

мкг/кг

нет правила

15 ÷ 60

мкг/кг

нет правила

15 ÷ 60

мкг/кг

Нет правила

15 ÷ 60

мкг / кг

Нет правила

15 ÷ 60

мкг / кг

Нет правила

15 ÷ 160

мкг / кг

Нет правила

150 ÷ 600

мкг / кг

Линейная зависимость концентрация(мг/кг)/

площадь пиков контаминированных образцов)

0,9999

у =

4.3217x +

3265

0,9798

у =

0.0271x-0,53

0931

у =

0.2006x-1,215

0,9969

у =

0.5245x-1,675

0,9959

у =

2.9831x-4,655

0,9581

у =

0.059x +

0275

0,9988

у =

0.0313x-0,13

0,9998

у =

0.2371x-1,68

0,9831

у =

0.118x-4,79

Линейная зависимость концентрация (мг/кг)/

площади пиков стандартных растворов

0961

у =

6.0959x

-27715

0,9777

у =

0.0409x

-0,6633

0979

у =

0.3748x-0,965

0,9337

у =

0.5127x 9,535

0,9569

у =

3.4013x

43,5

0,9943

у =

0.0792x 0,555

0,9915

у =

0.0507x

0,14

0,9966

у =

0.5074x-0,77

0,9475

у =

0.0934x 14,437

Выводы

Представленный метод подходит для определения остаточных количеств хинолонов в пчелином меде.

Метод валидирован и каждый из компонентов анализируется отдельно, в соответствии с правилами, касающимися валидации методов.

Предлагается одна и та же пробоподготовка и инструментальный анализ для всех определяемых анализируемых вешеств, т.е. нет подразделения в зависимости от того являются ли хинолоны кислотными или основаниями.

Метод прост в использовании для повседневной работы лаборатории, осуществляющей контроль наличия ветеринарно-медицинских препаратов в пищевых продуктах и продуктах животного происхождения.

Литература

  1. Catherine M. Oliphant, P. d., Gary M. Green, M.D (2002). "Quinolones: A comprehensive Review." Clinical Pharmacology, American Family Physician 65(3): 455-464.
  2. Commission Decision 657/2002/EU
  3. Commission Regulation (EU) No 37/2010
  4. 4.Eric Verdon, P. C. (2004). "Multi-matrix determination of 10 quinolones by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection."
  5. Florida Department of Agriculture and Consumer Services (2006) “Preparation and LC/MS/MS Analysis of Honey for Fluoroquinolone Residues” FDA U.S. Food and Drug Administration
  6. J.C.Yorke, J. B., E.Verdon, M.Laurentie, M.Juhel-Gaugain, P.Maris, P.Sanders (2002). "Validation of a multi-quinolone, multi-matrix, mutli-species method for the determination of quinolone residues by HPLC with fluorescence detection."
  7. Jay E.Renew, C.-H. H. (2004). "Simultaneous determination of fluoroquinolone, sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography-electrospray mass spectrometry." Journal of Chromatography A 1042: 113-121.
  8. Karsten Siegmund, S. M., Sukunath Narayanan,William Connors, Mathias Riedrich, Michael Printz, Clemens Richert (2005). "Molecular details of quinolone-DNA interaction: solutionstructure of an unusually stable DNA duplex with covalently linked nalidixic acid residues and non-covalent complexes derived from it." Nucleic Acid Reserch 33(15): 4838-4848.
  9. Kaufmann et al. (2002) “Quantitative LC/MS-MS determination of sulfonamides and some other antibiotics in honey”, Journal of AOAC Int, Vol 85, №4
  10. M. P. Hermo, E. N., S. Kir, D. Baron, J. Barbosa (2008). "Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC-UV, LC-FD, LC-MS and LC-MS/MS and validation in line with regulation 2002/657/EC." Analytica Chimica Acta 613: 98-107.
  11. Marilyn J. Schneider, S. E. B., Ixchel Reyes-Herrera, Dan J. Donoghue (2007). "Simultaneous determination of fluoroquinolones and tetracyclines in chicken muscle using HPLC with fluorescence detection." Journal of Chromatography B B(846): 8-13.
  12. Martin D.Rose, J. B., George W.F. Stubbings (1998). "Extension of multi-residue methodology to include the determination of quinolones in food." The Analyst 123: 2789-2796.
  13. Nicola H. Davies, M. R. E., David V. McCalley (2007). "A study of retention and overloading of basic compunds with mixed-mode reversed-phase/cation exchange columns in high performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A A(1138): 65-72.
  14. Noel S. Quiming, N. L. D., Yashihiro Saito, Ikuo Ueta, Mitsuhiro Ogawa, Kiyokatsu Jinno (2007). "Effect of Counter-Anions on the Retention of Zwitterionic Quinolones in Reversed -Phase Liquid Chromatography." Journal of Liquid Chromatography and related technologies 30: 1343-1360.
  15. O.Ballesteros, I. T., V.Sanz-Nebot, A.Navalon,J.L.Vilchez,J.Barbosa (2002). "Optimization of the Composition and pH of the Mobile Phase Used for Separaton and Determination of a Series of Quinolone Antibacterials Regulated By the European Union." Chromatographia 56(7/8): 413-421.
  16. Organization, World Health (1998). "Use of quinolones in food animals and potential Impact on human health." Report of a WHO Meeting, Geneva Switzerland.
  17. Rose Martin, Bygrave, J. and Stubbings, G.W. (1998) “Extension of multi-residue methodology to include the determination of quinolones in food” The Analyst, 123, 2789-2796
  18. Yu Yong-Jie Yu, Hai-Long Wu, Shao, Kang, Zhao, Wang, Zhu, Yu Ru-Qin (2011) “Using second-order calibration method based on trilinear decomposition algorithms coupled with high performance liquid chromatography with diode array detector for determination of quinolones in honey samples” Talanta 85


Назад в раздел