Эпидемиологическое состояние пасек при инфицировании семей пчел РНК-содержащими вирусами / Epidemiological status of apiaries bee colonies infected RNA-containing viruses

Еще фото

Автор (ы):  А.Е. Калашников, И.Г. Удина / A.E. Kalashnikov, I.G. Udina
Организация(и):  ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН / Vavilov Institute of General Genetics
УДК 638.145

Аннотация

Инфицирование ретровирусами ведет к серьезным нарушениям, вплоть до коллапса семей медоносной пчелы Apis mellifera и к сокращению численности популяций. Диагностика инфицирования и состава вирусов пчел при помощи метода ПЦР, особенно в условиях скрытого течения инфекции, позволяет предпринимать более эффективные меры для сохранения здоровых пчелиных семей на пасеках. Выявление смешанной (комбинированной) инфекции, особенно при одновременном поражении клещом Varroa destructor предполагает повышенный риск потери пчелиной семьи.

Summary

Retrovirus infection leads to serious breaches, until the collapse of honeybee colony and reduce populations of Apis mellifera. Diagnosis of virus infection by PCR, especially in the course of latent infection flow, allows to take more effective measures to maintain healthy bee colonies in apiaries . Identification of mixed (combined) infection, especially while defeat mite Varroa destructor suggests an increased risk of loss of the bee colony.


Медоносная пчела (Apis mellifera) является важной составляющей биоценозов в мировом производстве продуктов питания (миндаль, цитрусовые, ягоды, люцерна и др.) в качестве опылителя, а также производстве продуктов питания и лечебных средств (мед, прополис и пр.) (Klatt B.K., et al, 2013). В последние годы увеличились ежегодные потери пчелиных семей при нарушении их здоровья за счет паразитов (вирусы, бактерии, грибки, клещи) и изменений окружающей среды (гербициды, пестициды, загрязнение другими химическими веществами, структура кормов, культивирование трансгенных растений). Широко распространилось явление коллапса пчелиной семьи (Colony Collapse Disorder – CCD) (Cornman R.S., et al, 2012). Хотя причина CCD остается неизвестной, пострадавшие колонии имеют большое количество болезнетворных микроорганизмов, в том числе и РНК-вирусов (Chen Y.P., Siede R. et al, 2007, Удина И.Г. и др., 2010, Калашников А.Е., и др., 2012).

Вирусные инфекции могут протекать бессимптомно, вызывать деформации крыльев, паралич или смерть инфицированных особей (Siede R. et al, 2007). У некоторых отечественных пород существует высокий потенциал иммунитета пчел и устойчивость к заболеваниям, например, у среднерусской породы – подвида темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. (Кривцов Н.И., Кривцова Л.С., 2009).

В настоящее время известно несколько десятков вирусов, поражающих пчел. Среди них следует выделить шесть наиболее опасных, вызывающих необратимые клинические признаки заболевания, которые приводят к гибели пчел и их колоний. Это РНК-содержащие вирусы деформации крыла (deforming wing virus – DWV), вирус острого и хронического паралича (acute bee paralysis virus – ABPV и chronic bee paralysis virus – CBPV), Кашмирский вирус пчел (Kasmir bee virus – KBV), вирус мешотчатого расплода (sacbrood bee virus – SBV) и вирус черных маточников (black queen cell virus – BQCV). Все эти вирусы представлены вирионом, содержащим одну цепь геномной РНК.

Клещи Varroa destructor, при паразитировании на куколках и взрослых пчелах, служат как переносчиками этих вирусов, так и фактором, способствующим переходу вирусного заболевания из скрытой формы в открытую. Клещевая инфекция приводит к общему снижению иммунитета пчел (Nazzi F. et al, 2012).

Вирус деформации крыла (DWV) практически всегда связан с поражением клещом V.destructor и приводит к изменению формы крыльев у новорожденных пчел, из-за чего пчелы не могут летать. В больных семьях и около них могут быть обнаружены мертвые куколки и молодые пчелы с измененными крыльями. Гибель чаще всего наблюдается осенью или зимой.

Рис. 1. Пчела с деформацией крыльев, пораженная вирусом DWV

Вирус острого паралича (ABPV) – это болезнь взрослых пчел, вызывающая гибель пчел в течение нескольких дней, обычно в весенне-летний период.

Вирус хронического паралича (CBPV) поражает пчел в любое время года, но особенно летом при перегреве улья. Пчелы теряют ворсинки своего опушения, чернеют, ползают по земле под летком, наблюдается тремор конечностей и дрожание крыльев.

Кашмирский вирус (KBV) по действию похож на вирус ABPV, он вызывает гибель личинок, куколок и взрослых пчел на всех стадиях развития пчелиной семьи.

Рис. 2. Пчелы, пораженные вирусом CBPV. (a) Стрелка указывает на почерневшую лысую черную пчелу, которая более темная по сравнению со здоровыми пчелами. (b) Несколько погибших пчел за пределами улья (Ribière M. et al, 2010)

Инфекция вирусом мешотчатого расплода (SBV) проявляется чаще всего весной и при холодной погоде, взрослые личинки погибают перед их запечатыванием, принимая форму мешочка и далее высыхая.

Рис. 3. Личинка в сотах, пораженная вирусом SBV

Рис. 4. Личинка, пораженная вирусом SBV в виде характерной C-формы

Вирус черных маточников (BQCV) по своему действию похож на SBV, но при этом поражает предкуколок и куколок маток, а затем взрослых пчел. Куколки прекращают свое развитие и погибают, приобретая черный цвет. Заболевание наиболее сильно развивается в зимне-весенний период.

Рис. 5. Личинка матки, пораженная вирусом BQCV

Вирусные заболевания являются высоко контагенозными и распространяются, помимо переносчика клеща V. destructor, при контакте пчел, при инфицировании матки от нее к потомству, а также при работе с пчелами через инвентарь и продукты пчеловодства (Chen Y., et al, 2006).

Меры борьбы с заболеваниями, которые вызывают РНК-содержащие вирусы пчел, разработаны недостаточно хорошо, хотя существуют подобные методики для диагностики, например, лейкоза КРС (Удина И.Г. и др., 2005). Обычно проводят общие санитарные мероприятия (дезинфекцию сотов, ульев, инвентаря). Целесообразны любые меры, направленные на повышение иммунитета пчел, например, усиленное питание или использование биодобавок. Мед реализуют для пищевых целей без ограничений.

Нами изучено распространение РНК-содержащих вирусов на племенных пасеках и пасеках в условиях разведения в ряде регионов России. Проанализированы рабочие пчелы и образцы клещей из ульев, в которых наблюдали пестрый расплод, ослабление семей или наличие подмора в районе летка, или наличие варроатоза. Подобные исследования на территории России единичны.

Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен нами в 2009-2013 гг. в следующих выборках рабочих пчел среднерусской породы: Удмуртия – Завьяловский район (N=27 – общее количество пчел), д. Люк (N=9), д. Постол (N=6), д. Кенервай (N=18) и п. Позимь Якшур-Бодьинского района (N=33), Селычкинское лесничество (N=15), Юкаменский район (N=15), Кизнерский район (N=6) и Вавожский район (N=9); Тульская область (N=21); карники: Абхазия (N=15), Домодедовский район (Московская область) (N=12); карпатской породы: Ставропольский край (N=45), Майкопский район (Адыгея), (N=42), Истринский район (Московская область) (N=9).

Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен в образцах клеща Varroa destructor в Удмуртии: д. Кенервай Якшур-Бодьинского района (N=10) и (с рамки улья, N=10), д. Постол Завьяловского района (с личинки, N=10) (Рис. 6). Ранее результаты изучения РНК-содержащих вирусов пчел в Удмуртии описаны в публикации (Калашников А.Е. и др., 2013). Пчелы в Удмуртии были собраны сотрудниками Удмуртского НИИ животноводства Масленниковым И.В. и Колбиной Л.В, остальные выборки предоставлены пчеловодами-любителями, выборки в Адыгее собраны Удиной И.Г., в Абхазии – Воронецким В.И. и в Тульской области – Королевым А.В.

В наших исследованиях РНК-содержащие вирусы пчел определены по модифицированному методу ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией, где в первом цикле ПЦР образуется матрица к ДНК с вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы) (Berenyi O. et al, 1996, Chen Y.P. et al, 2006, Miranda J.R. et al, 2010, Удина И.Г. и др., 2010).

Рис. 6. Схема отбора образцов пчел

Рис. 7. Схема распространенности РНК-содержащих вирусов в России в 2010-2013 гг. В диаграммах указана доля встречаемости от общего количества инфицированных семей (сбор пчел для анализа проводили путем изъятия образцов из пораженных или подозрительных ульев с замором пчел под летком)

При помощи ОТ-ПЦР в выборках популяций пчел среднерусской породы (на территории Удмуртии, Ставропольского края, Московской, Тульской области), карпатской породы (Адыгея и Московская область) и карники (Абхазия) выявлено присутствие РНК-содержащих вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV. Наиболее часто обнаружены DWV (средняя частота в семьях пчел 50%) и SBV (48%), с меньшей частотой отмечены вирусы ABPV (16%), BQCV (13%), CBPV (12%) и KBV (9,6%). В Кизнерском районе Удмуртской республики на одной из пасек вирусы не были обнаружены. В Домодедовском районе Московской области был обнаружен только вирус DWV.

Установлена инфекция пчел одновременно двумя вирусами (в среднем от 33,9%) и более двух (вплоть до шести одновременно!) (от 21,2%). Наиболее часто встречался вариант 2-х, затем 5-ти и 3-х-кратного инфицирования, реже встречался 4-х и 6-кратное. Из множественных инфекций наиболее часто встречается комбинация вирусов DWV-ABPV-CBPV-SBV-BQCV (8,3%), а также комбинации DWV-APBV-KBV и APBV-CBPV-SBV (до 14,2% каждая). В некоторых случаях вирусная инфекция обнаружена у пчел без внешних признаков заболевания, что свидетельствует о том, что отсутствие клинических признаков заболевания не исключает инфицирования. Вспышки болезни могут возникнуть при любых неблагоприятных для пчелиной семьи условиях, которые приводят к снижению иммунитета. Множественная инфекция, особенно при одновременном поражении V.destructor, приводит к гибели пчелиных семей (Berenyi O. et al, 1996, Miranda J.R. et al, 2010 и Chen Y.P. et al, 2006).

Нами выявлено присутствие РНК-содержащих вирусов (DWV, ABPV) в клещах Varroa destructor, что подтверждает возможность переноса ими вирусов пчел (Chen Y.P. et al, 2006).

При сопоставлении полученных нами нуклеотидных последовательностей РНК-содержащих вирусов пчел DWV (GQ422786, JX993278, KC138854, KC138852, KF274666), SBV (KC020673, KC020674, KF274667, KF274668) и BQCV (KC138853) из отечественных популяций пчел с последовательностями, ранее зарегистрированными в Genbank, установлена высокая степень их идентичности (не менее 85%).
Выводы

Для предотвращения распространения вирусных заболеваний необходимо проводить ДНК-диагностику РНК-содержащих вирусов пчел (DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV). Важно внедрять ПЦР-диагностику вирусных заболеваний пчел на пасеках и в племенных хозяйствах на территории России и СНГ, а также для всех ввозимых пчелосемей с территории Европы и Азиатского региона.

В России практика молекулярной диагностики для инфекций пчел применяется недостаточно эффективно и мало распространена, в основном, отдается предпочтение пассивному сбору статистики при клиническом проявлении заболеваний пчел без идентификации возбудителей, что может привести к чрезвычайно широкому распространению опасных вирусных инфекций и к угрозе выживания медоносной пчелы.

Литература

1. Калашников А.Е., Масленников И.В., Колбина Л.М., Удина И.Г. Генетическая дифференциация популяций медоносных пчел (Apis mellifera L.) и распространение РНК-содержащих вирусов на фоне эпизоотии клеща Varroa destructor на территории Удмуртии // Сельскохозяйственная биология. – 2013; №4. – С.88-92.
2. Кривцов Н.И., Кривцова Л.С. Генетические предпосылки устойчивости пчел к болезням // Пчеловодство. – 2009; №3. – С.5-7.
3. Удина И.Г., Кунижева С.С., Гришечкин А.Е., Калашников А.Е., Учаева В.С., Кривцов Н.И., Злобин В.И. Обнаружение вируса деформации крыла у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в Московской области методом ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии. – 2010; – №5. – С.37-40.
4. Удина И.Г., Фалынскова И.Н., Трухин А.С. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза // Сельскохозяйственная биология. – 2005; №4. – С.122-125.
5. Berenyi O., Bakonyi N., Derakhshifar I., Koglberger H., Nowotny N. Occurrence of six honeybee viruses in diseased Austrian apiaries // Appl Envir Microbiology. – 2006; №.4. – P.2414-2420.
6. Chen Y.P., Pettis J.S., Collins A., Feldaufer F. Prevalence and Transmission of Honeybee Viruses // Appl Envir Microbiology. – 2006; №1. – P.606-611.
7. Chen Y.P., Siede R. Honey bee viruses // Adv Vir Research. – 2007; – P.33-80.
8. Chen Y., Evans J., Feldlaufer M. Horizontal and vertical transmission of viruses in the honey bee Apis mellifera // J Invertebr Pathology. – 2006; №3. – P.152-159.
9. Cornman R.S., Tarpy D.R., Chen Y., Jeffreys L., Lopez D., Pettis J.S., van Engelsdorp D., Evans J.D. Pathogen webs in collapsing honey bee colonies // PLoS. – 2012; №8. – P.43562.
10. DeMiranda J.R., Genersch E. Deformed wing virus // J Intertebr Patology. – 2010; №1. – P.48-61.
11. Klatt B.K., Holzschuh A.,Westphal C.,Clough Y., Smit I., Pawelzik E., Tscharntke T. Bee pollination improves crop quality, shelf life and commercial value // Proc Biol Sci. – 2013; – Р. 281(1775).
12. Nazzi F., Brown S.P., Annoscia D., Piccolo F.D., Prisco G.D., Varrichio P., Vedora G.D., Cattonaro F., Caprio E., Pennachio F. Synergetic parasite-pathogen interactions mediated by host immunity can drive the collapse of honeybee colonies // PLOS Pathogens. – 2012; №6. – P.1002735.
13. Ribière M., Olivier V., Blanchard P. Chronic bee paralysis: A disease and a virus like no other // Journal of Invertebrate Pathology. – 2010; January. – P .S120–S131.


Назад в раздел