Распространение РНК-содержащих вирусов у медоносной пчелы Apis mellifera L. на территории России
Распространение РНК-содержащих вирусов у медоносной пчелы Apis mellifera L. на территории России
Еще фото

Автор (ы):  А.Е. Калашников, И.Г. Удина
Организация(и):  Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва

Ключевые слова: пчелы, Apis mellifera L., вирусы пчел, вирус деформации крыла, вирус мешотчатого расплода, вирус черных маточников, кашмирский вирус пчел, вирус острого паралича, вирус хронического паралича, ассоциации вирусов пчел, варооз, Varroa destructor

Аннотация

Заражение пчел клещом служит предрасполагающим фактором для вирусного инфицирования пчел. Выявлено, что пчелы поражаются более чем 18 РНК-содержащими вирусами, не менее шести из которых являются смертельно опасными для пчелиной семьи. В настоящей статье рассматривается распространенность РНК-содержащих вирусов пчел в отдельных регионах России, а также в Абхазии.

Введение

Научный интерес к вирусным заболеваниям пчел в течение последних нескольких лет постоянно растет. Обнаружено по крайней мере 18 различных вирусов, поражающих семьи медоносной пчелы Apis mellifera L. Несмотря на то, что клинические симптомы проявляются не во всех случаях (иногда проявляются на фоне неблагоприятных условий для пчелиной семьи), вирусные заболевания приводят к серьезным и даже смертельным случаям, вплоть до гибели всей колонии пчел и исследование вирусных инфекций имеет большое экономическое значение для животноводства.

Заражение пчел клещом V. destructor является предрасполагающим фактором для инфицирования пчел вирусами (1). Взрослые клещи паразитируют на взрослых пчёлах и личинках, питаясь их гемолимфой. Инвазия клеща V. destructor привела к гибели диких пчелиных семей во многих областях России и является основной проблемой при содержании пчел на пасеках. Первоначально клещи Varroa были обнаружены в Юго-Восточной Азии примерно в 1904 году (в качестве паразита индийской пчелы Apis cerana indica), но теперь присутствуют на всех континентах, кроме Австралии.

С одной стороны, клещ является резервуаром для векторов вируса, с другой стороны, инвазия клеща ослабляет иммунитет пчел и способствует развитию вирусной инфекции (2). Во время инвазии клеща V. destructor ослабляется иммунитет пчел, снижается уровень экспрессии генов, вырабатывающих основные антибактериальные и противовирусные белки (3), что обуславливает развитие заболеваний, в том числе вирусного происхождение (4).

Из обнаруженных вирусов медоносной пчелы шесть вирусов вызывают такие тяжелые последствия при инфицировании как гибель пчелиных семей. Это вирусы: деформации крыла (DWV), вирус острого паралича (ABPV), вирус хронического паралича (CBPV), кашмирский вирус (KBV), вирус мешотчатого расплода (SBV), вирус черных маточников (BQCV) (5). По последним данным также является опасным инфицирование вирусом израильского паралича, вызвавшего гибель большого количества колоний пчел в Израиле (6).

Заражение SBV пчел приводит, в первую очередь, к смерти личинок. Инфицированные личинки не в состоянии окукливаться, и жидкости их органов скапливаются вокруг личинки, образуя мешок, и погибают, образуя темно-коричневый труп в форме «лодочки». Взрослые пчелы также поражаются этим вирусом, однако внешние клинические признаки заболевания отсутствуют. SBV проявляется в основном весной, когда начинается сезон размножения пчелиной семьи. В этот период в семье может присутствовать большое количество инфицированных молодых особей пчел.

CBPV передается через раны и пищу. Клиническим проявлением заболевания является тремор конечностей, крыльев, пчелы не могут летать, ползают, ассиметрично раскинув крылья. Пчелы лысеют и при потере волосяного покрова выглядят черными. При охране семьи происходит элиминация больных пчел. От этого вируса пчелиная семья погибает в течение нескольких дней, хотя в 30% случаях инфекция рабочих пчел может оставаться незаметной, и пчелы могут спонтанно выздоравливать от этого вируса.

Заболевание BQCV возникает у взрослых особей, однако клинические проявления заболевания наблюдаются у куколок маток. Особенно ярко заболевание проявляется весной и в начале лета в период размножения семьи. Отдельные симптомы заболевания похожи на поражение SBV, − зараженные куколки маток погибают и темнеют, а клеточные стенки приобретают черный цвет.

Инфицирование DWV тесно коррелирует с инвазией клеща V. destructor (4, 5). Вирус по колонии распространяется медленно, и инфицированные куколки развиваются во взрослых особей, имеющих крылья неправильной формы. Кроме деформации крыльев, у взрослых пчел не наблюдается других симптомов заболевания.

Инфекция ABPV обычно проявляется у практически здоровых взрослых пчел. Предположительно, ABPV играет роль при внезапном коллапсе колоний пчел (colony collapse disorder, CCD), которые были заражены клещом V. destructor. В связи с распространением клеща V. destructor в Европе инфекция ABPV приобрела большое значение (1, 4, 5, 6).

KBV поражает как выводок, так и взрослых пчел. Взрослые пчелы погибают в течение нескольких дней после заражения. Личинки могут выживать и становиться носителями вируса. Инфекция KBV связана с наличием инфекции ABPV (6), однако в Европе такие случаи комбинации редки.

Необходимо отметить, что в случае поражения вирусными заболеваниями матки, весь расплод является инфицированным теми же вирусами (8).

Материалы и методы

Нами были проанализированы выборки пчел карпатской породы с территории Ставропольского края (СК) (N=93), Адыгеи (N=42) (РА), Московской области Истринского (N=9) (МОИ) и Домодедовского районов, (N=12) (МОД), Тульской области (N=21) (ТУ), серой горной породы с территории Абхазии (N=15) (АБ), средне-русской породы с территории Удмуртской республики (N=30) (УД). Определение присутствия вирусной инфекции проводили методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), так как генетический материал вируса представлен РНК и на первом этапе ОТ-ПЦР образуется к ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Полученная ДНК служит матрицей на последующих этапах ОТ-ПЦР. Перед постановкой ОТ-ПЦР выделяли пул РНК из живых или замороженных образцов пчел. Выделение РНК проводили с применением набора Trizol (Изоген, Россия), ОТ-ПЦР - с применением набора GenPack RT-PCR Core (Изоген, Россия). В работе мы использовали праймеры для ОТ-ПЦР, предложенные ранее для изучения зарубежных популяций пчел (7), температура отжига составляла 52ºС. Исследовали по 3 пчелы из каждой семьи, где наблюдалась гибель пчел, либо присутствовали клинические признаки заболевания и варооз. ОТ-ПЦР проводили на приборе BioRad MyCycler (США).

Результаты и обсуждение

Мы целенаправленно отбирали образцы биологического материала на пасеках, где погибло не менее 20% пчелиных семей, и не менее 37% из них были поражены вароозом.

В табл.1 указаны число исследуемых семей N (в скобках общее количество обследованных пчел), а также количество семей, где обнаружен каждый из вирусов (в скобках указана частота встречаемости вирусов, здесь и далее рассчитанная относительно общего количества семей в выборке исследованной популяции).

Показано, что практически во всех семьях исследуемых выборок наблюдалась вирусная инфекция (с частотами от 0,7000 до 0,8387) (табл. 1). На первом месте по распространенности стоит DWV, который встречался во всех регионах. Затем SBV (везде, кроме МОД), ABPV (везде, кроме Московской области), CBPV (в СК, РА, ТУ, АБ, но не наблюдался в Московской области). Наименее встречались KBV и BQCV, которые встречались только в РА, ТУ и АБ. Встречаемость вирусов внутри выборок отдельных популяций отличалась (рис.1, табл.1). В СК наиболее распространенным был SBV и ABPV, в РА − DWV и ABPV с CBPV, в МОИ и МОД − DWV (причем в МОД только один улей из четырех был заражен) и SBV (только в МОИ), в ТУ и АБ все шесть вирусов были широко распространены, в УД - ABPV, DWV и SBV (с частотой в 1,75 раза меньшей) (рис. 1). В Европе наиболее часто выявлялись вирусы (в порядке убывания) DWV, BQCV, SBV и KBV (7) и DWV, ABPV, SBV, BQCV, CBPV и KBV (5). Однако в наших исследованных выборках эта тенденция не соблюдается во всех случаях (табл. 1), например, в выборке СК наиболее распространен SBV и BQCV встречался реже.

Мы проанализировали частоты встречаемости комбинированной инфекции (сразу несколькими вирусами одновременно (табл. 2). В табл. 2 указана встречаемость комбинированной инфекции в ульях (в скобках указана частота явления). В СК выявлено до четырех вирусов одновременно, в РА до пяти вирусов, в МОИ − до двух, в ТУ − до шести, в АБ − до шести, в МОД − только один вирус, в УД до трех вирусов. По данным о распространенности вирусных инфекций пчел в Европе также показано (5, 6, 7), что 20% инфекций обусловлено более, чем двумя вирусами пчел. При этом наблюдались следующие комбинации (табл. 3): наиболее часто встречалась комбинация DWV-ABPV, затем ABPV-CBPV и ABPV-CBPV-KBV, и лишь в одном случае в РА наблюдалась комбинация ABPV-KBV (5, 6, 7).

В работах Береней О. с соавторами и Миранда Дж. с соавторами также выявлены комбинативные инфекции DWV-APBV, DWV-ABPV-SBV, DWV-SBV-ABPV, DWV-ABPV-SBV-BQCV, DWV-ABPV-BQCV, DWV-SBV, DWV-BQCV, DWV-SBV-BQCV (5, 6). Известно, что комбинация вирусов ABPV-CBPV-KBV является комплексом вирусов, одновременно поражающих пчел и развивающихся в пчелах на стадии от куколки и личинки до стадии взрослой особи. Такие комбинативные инфекции, вероятно, играют значительную роль в распространении явления “коллапса” пчелиных семей (CCD), приводя к высокой вероятности гибели всей пчелиной семьи (6) и создавая угрозу для сохранения пчел.

Нами также ранее проведен анализ нуклеотидной последовательности фрагмента VP2-VP1 вируса DWV (GenBank - GQ422786) (9, 10), полученной в Московской области. Методом молекулярной филогении установлено, что экспансия DWV произошла в популяциях пчел в России относительно недавно (10).

Выводы

Таким образом выявлено, что в отдельных регионах России и в Абхазии в тех ульях, где наблюдается гибель пчел, а также инвазия клеща Varroa destructor, присутствует инфицирование пчел РНК-содержащими вирусами, приводящими к летальному исходу. Также обнаружено, что в большинстве выборок наблюдается комбинированная инфекция, которая усугубляет эпизоотическую ситуацию, так как опасность гибели пчелиной семьи при комбинированной инфекции возрастает.

Работа поддержана грантом РФФИ-офи_ц 08-04-13740.

Литература

1. Allen M., Ball B. V. The incidence and world distribution of honey bee viruses // Bee World. 1996. V.77. P.141–162.

2. Nordstom S., Fries I., Aarhus A., Hansen H., Korpela S. Virus infection in Nordic honey bee colonies with no, low or severe Varroa jacobsoni infestations // Apidologie. 1999. V.30. P.475–484.

3. Yang X. and Cox-Foster D. L. Impact of an ectoparasite on the immunity and pathology of an invertebrate: Evidence for host immunosuppression and viral amplification. // Proc Nat Ac Sci. 2005. Vol. 102. No. 21. P. 7470 – 7475.

4. Ball B. V., Allen M. The prevalence of pathogens in honey bee (Apis mellifera) colonies infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni // Ann Appl Biol. 1998 V.813. P.237–244.

5. Berenyi O., Bakonyi N., Derakhshifar I., Koglberger H., Nowotny N. Occurrence of six honey bee viruses in diseased Austrian apiaries // Appl Envir Microbiol. 2006. V.72. N.4. P.2414-2420.

6. Miranda J.R., Cordoni G., Budge G. The acute bee paralysis virus- Kashmir bee virus- Israeli acute paralysis virus complex // J Invertebr Pathol. 2010. V.103. N.1. P.30-47.

7. Autunez K., Anido M., Garrido-Bailon E., Botias C., Zunino P., Martinez-Salvador A., Martin-Hernandez R., Wiger H. low prevalence of honeybee viruses in Spain during 2006 and 2007 // Res Vet Sci. 2012. April 16 (в печати).

8. Chen Y.P., Pettis J.S., Collins A., Feldlanter M.F. Prevalence and transmission of honey bee viruses // Appl Environ Microbiol. 2006. V.72. N.1. P.606-611.

9. Удина И.Г., Гришечкин А.Е., Калашников А.Е., Злобин В.И., Кривцов Н.И. Идентификация вируса деформации крыла (DWV) у медоносной пчелы // Вестник РАСХН. 2010. №1. С. 69-71.

10. Удина И.Г., Кунижева С.С., Гришечкин А.Е., Калашников А.Е., Учаева В.С., Кривцов Н.И., Злобин В.И Обнаружение вируса деформации крыла у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в Московской области методом ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии. 2010, №5. С.37-40.

Рис. 1 Распространение РНК-содержащих вирусов в изученных регионах России и Абхазии.


Назад в раздел